無(wú)論正在利用何種相互作用，液相柱色譜法都分六個(gè)步驟進(jìn)行：

柱平衡

樣品裝載

洗滌

洗脫

清洗

色譜柱再生

         一、柱平衡：

        大多數(shù)液相色譜方案從樹(shù)脂平衡步驟開(kāi)始。與目標(biāo)蛋白質(zhì)和所選樹(shù)脂相容的緩沖液通過(guò)柱子。一種常見(jiàn)的做法是用 5-10 柱體積 (CV) 的平衡緩沖液平衡柱。例如，蛋白質(zhì)與疏水相互作用樹(shù)脂的結(jié)合在高離子強(qiáng)度下有效。

         在選擇平衡緩沖液時(shí)也要考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性，因?yàn)殡x子強(qiáng)度等緩沖液因素會(huì)受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的限制；通常，人們會(huì)避免使用會(huì)使感興趣的蛋白質(zhì)變性或阻止其與固定相相互作用的平衡緩沖條件。

        二、樣品加載：

         平衡后，將樣品加載到色譜柱上。樣品通常加載在與平衡緩沖液組成相同的緩沖液中，以最大限度地提高蛋白質(zhì)與固定相的相互作用。

         樣品可以手動(dòng)上樣或使用樣品泵。某些類(lèi)型的色譜法會(huì)限制可加載到色譜柱上的樣品體積。另一個(gè)重要的上樣考慮因素是大多數(shù)樹(shù)脂結(jié)合蛋白質(zhì)的能力有限。上樣過(guò)多導(dǎo)致色譜柱過(guò)載會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生不利影響。

          樣品過(guò)載會(huì)影響色譜柱柱效，色譜柱受到污染不僅影響柱效更會(huì)降低使用壽命。在柱前安裝保護(hù)柱可以有效保護(hù)分析柱免受污染。恒譜生色譜保護(hù)柱能過(guò)濾所有顆粒，積累非特定吸附材料，還將延長(zhǎng)在微堿性pH下使用的分析主柱的壽命。

        三、洗柱：

        一旦蛋白質(zhì)被固定在固定相上，只與樹(shù)脂微弱或非特異性相互作用的蛋白質(zhì)通過(guò)用幾柱體積的洗滌緩沖液洗滌柱子來(lái)去除。這種洗滌緩沖液可以具有與平衡緩沖液相同的成分或包含破壞弱特異性相互作用的成分。

       例如，固定化金屬親和層析 (IMAC) 用高濃度的咪唑洗脫與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。一種常見(jiàn)的做法是使用包含中等濃度咪唑的洗滌緩沖液，以消除僅與樹(shù)脂微弱結(jié)合的污染蛋白質(zhì)。洗滌液相色譜柱子直到在洗脫液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。當(dāng)使用帶有 UV 檢測(cè)器的色譜系統(tǒng)時(shí)，洗滌色譜柱直到 280 nm 吸收讀數(shù)回到基線。

          四、樣品洗脫：

          在所有非特異性和弱相互作用的蛋白質(zhì)都從樹(shù)脂上洗掉后，通過(guò)改變通過(guò)樹(shù)脂的緩沖液的組成，與樹(shù)脂強(qiáng)烈相互作用的蛋白質(zhì)會(huì)從柱子上洗脫下來(lái)。在離子交換色譜中，蛋白質(zhì)用高離子強(qiáng)度的緩沖液或通過(guò)改變 pH 值來(lái)洗脫，以破壞固定目標(biāo)蛋白質(zhì)的靜電相互作用。相反，與疏水相互作用樹(shù)脂結(jié)合的蛋白質(zhì)通過(guò)降低緩沖液的離子強(qiáng)度來(lái)洗脫。在親和層析中，蛋白質(zhì)通常通過(guò)引入競(jìng)爭(zhēng)配體或通過(guò)切割親和標(biāo)簽從柱中洗脫，也可以使用高鹽緩沖液或改變 pH 值進(jìn)行洗脫。其他洗脫方案可能涉及混合不同極性的溶劑以調(diào)整流動(dòng)相中每種組分的溶解度。

          洗脫條件可以線性梯度方式或逐步方式改變。通常，選擇梯度洗脫方案（其中流動(dòng)相的組成隨時(shí)間線性變化）來(lái)確定洗脫曲線和使感興趣的蛋白質(zhì)從樹(shù)脂中釋放出來(lái)的洗脫緩沖液濃度。一旦確定了該濃度，為了節(jié)省時(shí)間，可以設(shè)計(jì)一個(gè)逐步等度洗脫方案，其中流動(dòng)相的組成在每一步都是恒定的，可以設(shè)計(jì)用于未來(lái)的純化。

           注意：尺寸排阻色譜不需要更換緩沖液，因?yàn)樗灰蕾?lài)于流動(dòng)相和固定相之間的特定相互作用。沒(méi)有真正的洗滌和洗脫步驟，因?yàn)?SEC 僅依賴(lài)于大分子被多孔珠延遲的事實(shí)，而小分子以最小的樹(shù)脂相互作用通過(guò)樹(shù)脂。

           五、清洗：

            在目標(biāo)蛋白質(zhì)從樹(shù)脂中洗脫后，任何與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白質(zhì)都將通過(guò)增加洗脫緩沖液的強(qiáng)度進(jìn)行洗脫。此步驟允許色譜柱重復(fù)用于將來(lái)的分離。

            六、色譜柱再生：

          在剝離與介質(zhì)結(jié)合的剩余化合物后，柱子要么用平衡緩沖液飽和以供后續(xù)重復(fù)使用，要么用存儲(chǔ)緩沖液填充。